Ricerca

Le ricerche svolte da Francesco Capozzi hanno a comune denominatore lo studio di sistemi biologici (di origine batterica, vegetale o animale) contenenti metalli, attraverso diverse tecniche strumentali, prima fra tutte la spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR).

In particolare, le ricerche sono mirate:
a) allo studio delle proprietà magnetiche di metalli paramagnetici attraverso misure rilassometriche;
b) alla delucidazione del ruolo di ioni metallici nella funzione di metallo-proteine;
c) allo studio degli alimenti e dei loro prodotti di trasformazione, con predilezione dell’aspetto bio-inorganico, mediante l’impiego delle risonanze magnetiche;
d) alla individuazione delle relazioni esistenti tra struttura e funzione di metallo-enzimi coinvolti nei processi di biodegradazione.

Ruolo dell’intorno proteico nella modulazione del potenziale di riduzione micro- e macroscopico del cluster [Fe₄S₄] delle proteine ferro-zolfo ad alto potenziale (HiPIP).

Le HiPIP sono proteine ferro-zolfo ad alto potenziale di riduzione (E°’ compreso tra +90 e +450 mV) che partecipano ai processi di trasferimento elettronico durante la fotosintesi batterica. Il loro centro redox consta di un cluster [Fe₄S₄] costituito da quattro ioni ferro, organizzati secondo una geometria a cubano, ciascuno di essi coordinato da tre ioni S^2- e dal gruppo tiolato di una cisteina che collega il centro metallico allo scheletro polipeptidico della proteina (Figura 1).

La geometria di coordinazione degli ioni metallici è, in prima approssimazione, tetraedrica e gli ioni ferro sono nello stato ad alto spin. Il cluster può esistere in due stati di ossidazione: quello ossidato in cui, formalmente, ci sono tre ioni ferrici ed uno ferroso, e quello ridotto che presenta due ioni ferrici e due ferrosi. Gli stati super-ossidato e super-ridotto non sono accessibili nelle condizioni fisiologiche.

Le spettroscopie NMR, EPR, Mössbauer e ⁵⁷Fe-ENDOR hanno permesso di ottenere informazioni più dettagliate sulla reale distribuzione elettronica all’interno del cluster. I dati EPR, registrati alla temperatura dell’elio liquido sulla forma ossidata della HiPIP II da E. halophila, hanno mostrato un segnale con g leggermente superiore a 2.00, consistente con uno spin netto per lo stato fondamentale del cluster pari a S=1/2. Tuttavia, dagli spettri EPR di tutte le altre HiPIP risultano evidenti almeno due specie (caratterizzate da valori di g significativamente diversi tra loro) interpretabili ammettendo l’esistenza, per la stessa proteina, di un cluster con due distinte distribuzioni elettroniche. Tale quadro è consistente anche con i dati NMR, registrati a temperatura ambiente, ed i parametri degli spettri Mössbauer, raccolti alla temperatura dell’elio liquido. Gli spettri NMR mostrano 8 segnali, corrispondenti ai protoni b-CH₂delle 4 cisteine leganti il cluster, caratterizzate da uno shift iperfine che indica l’esistenza di due coppie di ioni: la prima a valenza ferrica pura mentre l’altra, costituita da uno ione ferrico ed uno ferroso, risulta essere a valenza mista (Fe^2.5+) a causa della delocalizzazione di un elettrone sulla coppia di ioni. Tale modello è suffragato anche dal fatto che lo spettro Mössbauer è perfettamente simulato da due coppie di ioni ferro di aree equivalenti, una con shift isomerico tipico dello stato di ossidazione +3, l’altra caratterizzata da shift isomerico intermedio tra quello dello stato ferrico e quello dello stato ferroso. Inoltre, l’accoppiamento anti-ferromagnetico tra le due coppie di ioni (quella ferrica con S₁₂=3 e quella mista con S₃₄=7/2) porterebbe allo spin totale per il cluster S=1/2 emerso dalla spettroscopia EPR.

Al contrario dei cluster [Fe₄S₄] simmetrici di origine sintetica, ove ciascuno ione ferro è perfettamente equivalente agli altri, nel caso delle HiPIP, la presenza dell’intorno proteico anisotropo elimina ogni forma di equivalenza chimica. In tal senso, per queste proteine, è possibile ipotizzare sei possibili isomeri elettronici a seconda della localizzazione della coppia a valenza mista e, di conseguenza, di quella ferrica pura, relativamente ai riferimenti geometrici introdotti dalla catena polipeptidica (Figura 2).

Nella fattispecie, ciascuno ione verrebbe ad essere etichettato attraverso il numero d’ordine con cui compare, nella sequenza peptidica, la cisteina che lo coordina. Pertanto, lo ione Fe-3 indica quello coordinato dalla terza cisteina (cisteina-III) che compare nella sequenza amminoaci-dica a partire dall’estremità N-terminale (Figura 3).

La spettroscopia NMR permette di assegnare lo stato di ossidazione di ciascun particolare ione ferro attraverso la posizione e la dipendenza dalla temperatura dello shift isotropico dei segnali relativi ai protoni delle cisteine coordinanti il cluster. Nel caso della HiPIP II da E. halophila, lo spettro presenta due coppie di segnali a campi alti (b-CH₂delle cisteine che coordinano la coppia ferrica pura) e due coppie a campi bassi (b-CH₂delle cisteine che coordinano la coppia a valenza mista) (Figura 4).

Nel caso di tutte le altre HiPIP, la distribuzione dei segnali può essere spiegata sulla base di un equilibrio, veloce nella scala dei tempi NMR, tra almeno due dei sei possibili isomeri elettronici (Figura 5).

La semplificazione a due soli isomeri presenti in equilibrio è sufficiente a spiegare lo spettro NMR di tutte le HiPIP fino ad oggi studiate. Non solo: i due isomeri presenti all’equilibrio in tutti i casi finora esaminati localizzano la valenza mista, rispettivamente, sulla coppia di ioni Fe-2 e Fe-3 e sulla coppia Fe-3 e Fe-4. Ciò equivale a dire che, nell’equilibrio, il Fe-3 resta sempre nello stato di ossidazione +2.5, mentre il Fe-1 ha sempre carattere ferrico puro.

La costante di equilibrio, deducibile dalla posizione nello spettro ¹H-NMR dei segnali relativi alla coppia dei protoni b-CH₂delle cisteine II e IV, dipende invece dal potenziale di riduzione individuale dello ione Fe-2 rispetto a quello dello ione Fe-4 (Figura 6).

Nella HiPIP II da E. halophila, il potenziale di riduzione individuale (o microscopico) di ciascuno ione ferro segue l’ordine Fe-3 > Fe-2 > Fe-4 > Fe-1, dal momento che la percentuale di carattere ferrico dello ione coordinato dalla cisteina-II è nulla. Nella HiPIP II da E. vacuolata, invece, lo spettro NMR indica la presenza dei due isomeri in rapporto 1:1 da cui è possibile dedurre che il potenziale di riduzione degli ioni ferro-2 e ferro-4 è pressoché identico.

Il lavoro di ricerca è proseguito proprio per definire sia l’aspetto termodinamico che quello cinetico del trasferimento elettronico mediato da questa classe di proteine. Dal punto di vista termodinamico, lo studio non può prescindere dalla ricerca dei meccanismi con cui l’intorno proteico riesce a modulare il potenziale di riduzione intrinseco del centro metallico. Gli effetti indotti dalla proteina sono dovuti a:

a) alterazioni della geometria del cluster e della natura dei leganti; b) differenze strutturali tra stati ridotto ed ossidato (energia di riorganizzazione); c) interazioni solvente-cluster; d) interazioni elettrostatiche tra cluster e proteina. Le interazioni elettrostatiche, ulteriormente modulate dall’effetto di schermo del solvente, comprendono:

i) quelle dovute a cariche unitarie superficiali (derivanti dalla ionizzazione, a pH fisiologico, di acidi aspartico e glutammico, arginina, lisina e istidina); ii) quelle dovute a cariche frazionarie sepolte nella proteina derivanti da gruppi polari (ad esempio quello ammidico).

Il mutante H42Q della HiPIP da C. Vinosum: la modulazione del potenziale di riduzione attuata dalle cariche unitarie superficiali-

Il potenziale di riduzione (E°) della HiPIP da C. vinosum dipende dal pH del mezzo in cui la proteina è disciolta, con una variazione di circa 50 mV osservabile durante la titolazione nell’intervallo tra pH 4 e pH 10, imputabile alla dissociazione degli acidi aspartico e glutammico e dell’istidina protonata. Inoltre, le forme ossidata e ridotta della proteina devono, necessariamente, presentare valori di pKa differenti fra loro, che possono essere calcolati attraverso il fitting dei dati sperimentali di titolazione con la funzione:

La proteina mutante H42Q non presenta la pH-dipendenza con pKa intorno a 6 (5.9 per la forma ossidata e 6.3 per quella ridotta) osservata invece nella HiPIP naturale, dal momento che nel mutante non sono presenti istidine. Infatti, l’istidina 42, unica presente in quella naturale, è stata sostituita da una glutammina. Il confronto tra le curve di dipendenza dalla temperatura del potenziale redox per entrambe le proteine, misurato a pH 4.8 e 8.3, ha permesso di stabilire che l’introduzione di una carica positiva sulla superficie della proteina causa un aumento di potenziale redox il cui termine entalpico è pari a 7.4 kJ mol-1 (ca. 75 mV). La determinazione della struttura cristallografica per la forma acida di entrambe le proteine ha permesso di escludere effetti diversi da quelli di natura elettrostatica.

Il mutante S79P della HiPIP da C. Vinosum: la modulazione del potenziale di riduzione attuata dai gruppi polari non esposti al solvente

Nei pressi del cluster [Fe₄S₄] sono localizzati gruppi ammidici ben sepolti nella matrice proteica, alcuni dei quali coinvolti nella formazione di legame a ponte di idrogeno con il gruppo tiolato delle cisteine leganti. Ad essi è associato un momento dipolare per cui è ipotizzabile un effetto considerevole sulla stabilizzazione della forma ridotta del cluster, non essendoci alcun effetto schermante dovuto al solvente. Al fine di determinare quantitativamente il contributo entalpico di tali dipoli elettrici al potenziale di riduzione del cluster [Fe₄S₄]³⁺ è stato progettato e preparato il mutante S79P, in cui la serina 79 dell’HiPIP di C.vinosum è stata sostituita, tramite mutagenesi sito specifica, con un residuo di prolina. In questo modo, è stato eliminato un gruppo N-H, coinvolto nel legame a ponte idrogeno con lo zolfo g della cisteina 77 legante il cluster, e rimpiazzato con un gruppo N-Cd, il cui momento dipolare è di gran lunga minore. La mutazione S79P è stata scelta sulla base dell’angolo F della serina 79, trovato identico a quello rigido e intrinseco di una prolina, per lasciare così inalterato il folding intero della proteina. Il potenziale di riduzione, misurato mediante voltammetria ciclica, della proteina mutata è risultata essere 104 mV più basso di quello della proteina naturale, a causa di una diminuzione del contributo entalpico, favorevole al processo di riduzione. Il contributo entropico rimane costante e sfavorevole alla riduzione, come risulta dalla dipendenza del potenziale dalla temperatura. La spettroscopia NMR indica che la mutazione introdotta non provoca alterazioni nella struttura della proteina. Inoltre, anche la posizione dell’equilibrio tra i due isomeri elettronici (Figure 5 e 6) resta pressoché invariata. I risultati della ricerca hanno evidenziato, quindi, che l’influenza del gruppo ammidico della serina 79 si manifesta attraverso un effetto elettrostatico generale piuttosto che con una interazione specifica (abolizione di un legame a ponte di idrogeno). Inoltre, l’effetto considerevole (un abbassamento del potenziale di riduzione di oltre 100 mV) pone l’accento sull’importanza che i dipoli elettrici associati ai gruppi polari sepolti nella proteina hanno sulla modulazione del potenziale di riduzione.

Il mutante C77S della HiPIP da C. Vinosum: la modulazione del potenziale di riduzione attuata dai leganti ed effetti sulla distribuzione elettronica del cluster

E’ stato preparato un mutante della HiPIP da C. vinosum (C77S) in cui una delle cisteine (la quarta nella sequenza primaria della proteina) è stata sostituita con una serina, cosicché uno dei leganti del cluster [Fe4S4] presenta l’ossigeno, invece che lo zolfo, come donatore. Le variazioni sulla distribuzione elettronica (quindi sul micropotenziale redox di ciascuno ione ferro) introdotte con la mutazione sono state studiate attraverso le spettroscopie Mössbauer, EPR e ⁵⁷Fe-ENDOR. I risultati ottenuti hanno permesso di stabilire che mentre nella forma ridotta della proteina naturale tutti gli ioni ferro sono indistinguibili, lo ione ferro legato alla serina nella proteina mutata, si differenzia dagli altri a causa della perdita di carattere covalente nel legame O-Fe rispetto a S-Fe, indicante uno spostamento della nuvola elettronica verso la serina. Nella forma ossidata della proteina mutata continuano a persistere la coppia a carattere ferrico puro e quella a valenza mista. Tuttavia, contrariamente alla HiPIP naturale, l’indagine spettroscopica ha evidenziato che l’equilibrio tra gli isomeri elettronici risulta spostato verso la specie in cui il Fe-4 (cioè quello coordinato dalla serina) appartiene alla coppia di ioni a carattere ferrico puro (l’isomero A della Figura 5 passa dal 45 al 65%). Inoltre, non è più possibile trascurare, nel mutante C77S, la presenza di un’ulteriore isomero, oltre ai due della proteina naturale, almeno alla temperatura di 7K.

Movimenti rapidi del cluster rispetto all’intorno proteico: aspetti dinamici nelle HiPIP ridotte e ossidate.

Attraverso la spettroscopia “Mössbauer dinamica” sono stati studiati i movimenti degli ioni ferro nel cluster [Fe4S4] della HiPIP I da E. halophila, della HiPIP da C. vinosum e del suo mutante C77S , tutte in entrambi gli stati ossidato e ridotto, nonché della forma ridotta, parzialmente denaturata con cloruro di guanidinio, dell’HiPIP da C. vinosum. I movimenti, che possono essere valutati attraverso il parametro dello spostamento quadratico medio <x²_t>, rientrano in una scala dei tempi inferiore ai 100 ns e forniscono dati sulla rigidità del cluster metallico relativamente alla “gabbia” costituita dalla molecola proteica, o, meglio, indica la flessibilità dello scheletro proteico attorno al cluster. Dai risultati emerge che tutte le proteine studiate sono caratterizzate da una mobilità media degli ioni ferro compresa tra quella osservata nei citocromi c e quella misurata nella deossi-emoglobina e nella deossi-mioglobina. Inoltre, è stato osservato che, nel caso delle proteine naturali, la forma ridotta risulta essere sensibilmente meno flessibile di quella ossidata a temperature più alte di 250K. Nel caso del mutante C77S, la forma ridotta è meno flessibile della proteina naturale mentre il comportamento è invertito nella forma ossidata. Infine, è stato confermato che il cluster ferro-zolfo gioca un ruolo predominante nella stabilità della struttura terziaria della proteina, dal momento che la parziale denaturazione della forma ridotta non modifica la struttura elettronica del cluster, e comporta valori di spostamento quadratico medio <x²_t>= 0.028 Å², compresi tra quelli della forma ossidata (0.037) e ridotta (0.024) della proteina non denaturata.

Aspetti cinetici nel trasferimento elettronico mediato dalle HiPIP: il percorso dell’elettrone dalla superficie proteica al cluster.

Nel processo di riduzione delle metalloproteine, l’elettrone “posato” dal donatore sulla superficie proteica deve attraversare la matrice polipeptidica (electron tunneling) per poter raggiungere il cluster metallico che, nelle HiPIP, risulta inaccessibile al solvente. Scopo della ricerca è stato quello di studiare il percorso seguito dall’elettrone in un processo di trasferimento intramolecolare da uno ione Ru²⁺, legato ad una istidina superficiale, al cluster [Fe4S4]³⁺. La posizione dell’istidina legante è stata modificata attraverso la preparazione di mutanti della proteina HiPIP da C. vinosum in cui l’unica istidina presente (His42) è stata spostata nelle posizioni 18, 20, 48, 50, 66, 78 e 81. La misura della costante cinetica di trasferimento (k_ET) effettuata su tutti i mutanti ha dato valori compresi tra 1.8·10⁶ (His50) e 6.1·10⁸ s^-1 (His81). La differenza tra questi due valori estremi, pari a 340 volte, è stata attribuita ad un percorso più corto di 5 legami nella His81 (7 legami sigma + 1 legame a ponte di idrogeno) rispetto a quello riscontrabile nella His50 (12 legami sigma + 1 legame a ponte di idrogeno). I risultati ottenuti hanno sottolineato l’importanza del ruolo svolto dai legami a ponte di idrogeno nel determinare il percorso migliore per il trasferimento elettronico intramolecolare.

Sviluppo di metodi spettroscopici applicabili nel settore delle Scienze degli Alimenti.

L’attività di ricerca è stata anche dedicata, non marginalmente, allo sviluppo di metodi spettroscopici utilizzabili nella valutazione della qualità degli alimenti. In particolare, sono state cercate le correlazioni esistenti tra i tempi di rilassamento nucleari dell’acqua contenuta negli alimenti e le caratteristiche chimico-fisiche della matrice alimentare che la contiene. Infatti, è noto che anche piccole variazioni nella concentrazione di ioni paramagnetici (soprattutto Fe^2+/3+ e Cu²⁺), ma anche nella loro accessibilità da parte del solvente, possano impartire drammatiche oscillazioni nei tempi di rilassamento trasversale e longitudinale dei protoni dell’acqua. I casi studiati hanno considerato due alimenti, la carne e l’uovo, importanti dal punto di vista nutrizionale, per cui è riportato in letteratura una variabilità della distribuzione e speciazione degli ioni, legata alla durata e allo stato di conservazione dell’alimento. Durante la trasformazione del muscolo in carne, i processi di glicogenolisi post-mortem, responsabili dell’abbassamento del pH, portano ad una parziale denaturazione della mioglobina e conseguente variazione nello stato di coordinazione dello ione Fe²⁺, fino alla sua ossidazione irreversibile. Nel secondo caso, è stato verificato, proprio dalla ricerca avviata, che un flusso di ioni Fe²⁺ procede dal tuorlo verso l’albume dell’uovo con una cinetica parallela all’aumento di rilassività nucleare dei protoni dell’acqua. Gran parte della ricerca è stata finora dedicata all’aspetto macroscopico di tali variazioni (è necessario valutare l’applicabilità di tali metodiche per “sollecitare” l’interesse da parte dei tecnologi alimentari). Tuttavia, ricerche atte a scoprire i dettagli molecolari di tali variazioni sono in svolgimento.